immunoprecise MQ 17.101-96說明書

roduct Name

Antibody Based Assay for PAD activity (ABAP)

 基于抗體的PAD活性試驗(ABAP)

CAT No.

MQ 17.101-96

Quantity

96 well test

免責聲明

該試劑盒僅供研發使用。不得用于診斷或治療程序。

在研究領域外使用需要ImmunoPrecise Antibodies的許可證。

產品描述

基于抗體的PAD活性試驗(ABAP)是一種用于測定細胞和組織裂解物中PAD酶活性的固體酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。此外，其可與重組PAD酶聯合用于PAD抑制試驗。將含精氨酸的肽包被在96孔板的條帶上。在每個試劑條上，用含脫亞胺精氨酸的肽包被孔H，作為陽性對照。在與重組PAD酶或含有PAD酶的細胞/組織裂解物孵育期間，精氨酸是  被  去亞胺化的。  用含PAD的溶液孵育后，清洗過量的酶  離開  和  a  單克隆  向孔中加入去亞胺精氨酸特異性檢測抗體。孵育后，洗滌孔并用HRP標記的多克隆抗小鼠免疫球蛋白抗體孵育。

使用HRP底物顯色微孔板可產生與已脫亞胺精氨酸量成正比的染色反應。在酶標儀中測定的光密度可直接與試驗中存在的對照酶的酶活性相關，從而定量PAD酶活性。

使用重組人PAD4驗證ABAP  （圖1）和多種PAD表達組織的小鼠組織裂解物（圖2）。

試劑

• ABAP 96孔板。每個試劑條的孔H用含脫亞胺精氨酸的肽包被，作為ABAP試驗中的陽性對照。所有其他孔均用含精氨酸的肽包被。

· 用于活性校準的人PAD酶（從細菌細胞裂解物中純化人PAD酶）。

· 含有疊氮化納作為防腐劑的脫亞胺緩沖液。

• 小鼠抗脫亞胺精氨酸。特異性結合脫亞胺精氨酸的專有ModiQuest Research小鼠單克隆抗體。

· HRP標記的抗小鼠Ig抗體。

需要但未提供的試劑和設備

• 如果使用四甲基聯苯胺(TMB)作為底物，則多孔酶標儀能夠在450 nm處讀數。如果使用不同的底物，應相應調整波長。

· 經校準的可調節精密移液器，用于5倍體積

μl和1000μl。

· 洗板機（選配）或歧管分配器。

· 加濕室。

· 各種尺寸的經校準燒杯和量筒。

· 渦旋混合器。

· 清洗緩沖液（PBS + 0.05%吐溫20）。

· 牛血清白蛋白(BSA)。

· 穩定顯色劑(TMB)。

· 2M H2SO4（終止液）。

注意事項

1. 專業用戶。

2. 與任何生物來源的產品一樣，應使用適當的處理程序。

• 該產品可與不同的樣本類型和材料配合使用，因此各個實驗室應對所采用的檢測系統進行驗證。

儲存/穩定性

· 人PAD酶

Store at -80 ℃下儲存。使用后，立即在-80 ℃下重新冷凍。

避免反復凍融循環。將酶一直置于冰上。

· ABAP 96孔板

Store at -20 ℃下儲存。

避免反復凍融循環。

· 小鼠抗脫亞胺精氨酸

在-20 ℃下儲存。*使用后，在4 ℃下儲存。避免反復凍融循環。

· HRP標記的抗小鼠Ig

在-20 ℃下儲存。*使用后，在4 ℃下儲存。避免反復凍融循環。

· 脫亞胺緩沖液

Store at -20 ℃下儲存。

 的制備

打開前，在4 ℃下旋轉含有MQR人PAD酶的小瓶。對于活性校準，PAD酶應在脫亞胺緩沖液(40 mM Tris-HCl pH 7.5；5 mM CaCl2；1 mM DTT)中以適當濃度（例如，從2.0至0.002 mU）稀釋，用于活性曲線。

每孔100µl脫亞胺緩沖液中2.0 mU PAD可產生大脫亞胺，而 < 0.002 mU PAD/孔無可檢測活性。

程序

• 用100µl脫亞胺緩沖液在37 ℃下預孵育96孔板30 min。該步驟是平衡ABAP板所必需的。
• 倒置倒空ABAP板，置于冰上。此外，將脫亞胺緩沖液置于冰上。
• 在冰冷的脫亞胺緩沖液中稀釋需要檢測PAD活性的組織裂解物。使用PAD活性校準樣本進行相同操作。每孔應加的總體積為100 μL（建議檢測不同濃度的裂解液。通常100 μL脫亞胺緩沖液中1 μL組織裂解液就足夠了）
• 將所有樣品加入ABAP板中，同時將所有樣品置于冰上。
• 在37 ℃的加濕室中孵育ABAP板1小時15 min。

6. 用清洗緩沖液清洗微孔板5次。

• 用清洗緩沖液 + 1%BSA以1:1000稀釋MQR小鼠抗脫亞胺精氨酸抗體。每孔加入100 μL抗體溶液。
• 在37 ℃的加濕室中孵育ABAP板1小時。

9. 用清洗緩沖液清洗微孔板5次。

• 用洗滌緩沖液 + 1%BSA以1:2000稀釋HRP標記的抗小鼠Ig抗體。每孔加入100 μL抗體溶液。
• 在37 ℃的加濕室中孵育ABAP板1小時。

12. 用清洗緩沖液清洗微孔板5次。

13. 用不含吐溫-20的清洗緩沖液清洗微孔板3次。

• 向各孔中加入50µl TMB底物，并使其呈藍色（室溫下避光）。

請注意：可實現快速開發。

• 向各孔中加入50µl 2M H2SO4以終止反應。藍色將變為黃色。

16. 在多孔酶標儀中讀取450 nm處的OD。

圖1：向包被含精氨酸肽的ABAP板中加入越來越多的重組人PAD酶，導致檢測到越來越多的含瓜氨酸肽。加入EDTA通過捕獲鈣離子消除PAD活性。

圖2：不同小鼠組織樣本中PAD活性的檢測。在含鈣(-EDTA)或去鈣(+ EDTA)對照反應中使用1μl組織裂解物，并通過標準ABAP程序監測PAD活性。將組織裂解物PAD活性歸一化為大重組人PAD活性(-EDTA)，并抑制人PAD(+ EDTA)。請注意：這是一張顯示ABAP測定能力的代表性圖片。